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嘌呤霉素 Puromycin(含量≥99.0%,细胞实验或动物实验)
起批量( 价格
1-5 ¥350元/支
≥5 ¥300元/支
  • 供货能力:100000
  • 最低订购量:1支
  • 可销售总数量:1000000支
  • 建议零销价:450元/支
  • 发布日期: 2018-05-17
  • 更?#27695;?#26399;: 2018-08-29
产品详细说明
品牌: Pharmabiology 产地: 美国
CAS号: 58-58-2 英文名称: Puromycin
保质期: 3年 保存条件: -20℃
货号: P32076-25MG

产品说明:蛋白质合成?#31181;?#21058;。?#31181;?#32454;菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。


嘌呤霉素(Puromycin)是由白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素,通过?#31181;?#34507;白质合成而杀死革兰氏阳性菌,各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠?#21496;?#20316;用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物,能够与核糖体的A位点结合并掺入到?#30001;?#30340;肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后,不会参?#33000;?#21518;的?#39759;?#21453;应,从而导致蛋白质合成的提前终止并?#22836;?#20986;C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。

嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC),赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。

嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关,现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下,嘌呤霉素亦可以?#32654;?#31579;选转化携带pac基因质粒的大肠?#21496;?#33740;株。


溶解性:溶于水,参考浓度50mg/ml。


使用方法


  1. 建议使用浓度

哺乳动物细胞:1-10 μg/mL,*浓度需要杀灭曲线来确定;

大肠?#21496;篖B琼脂?#22028;?#22522;筛选稳定转化pac基因的大肠?#21496;?#20351;用浓度为125μg/mL。注:使用嘌呤霉素筛选大肠?#21496;?#31283;转株需要精确的pH值调节,而且?#33449;?#20027;细胞本身的影响。

2.溶解方法

用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母?#28023;?#32463;0.22 μm?#22235;?#36807;滤除菌后分装于-20℃冻存;也可溶于甲醇,配制成10 mg/ml的储存液。

3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定(以shRNA转染或者慢病毒转导为例)

嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类?#27712;?#29983;长状态、细胞密?#21462;?#32454;胞代?#30970;?#20917;及细胞所处细胞周期位置等有关。为?#26494;?#36873;到稳定表达的shRNA细胞株,确定杀死?#37259;?#26579;/转导细胞的*浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线(kill curve)。


1) Day 1:24?#35013;?#20869;以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板,铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜;


2) Day 2:a)准?#24178;?#36873;?#22028;?#22522;:含不同浓度嘌呤霉素的新鲜?#22028;?#22522;(如0-15μg/mL,至少5个梯度);b)往孵育过?#36141;?#30340;细胞内更换新鲜配制的筛选?#22028;?#22522;;之后37℃孵育细胞;


3) Day 4:更换新?#23454;?#31579;选?#22028;?#22522;,并观察细胞存活率。


4) 根据细胞的生长状态,约2-3天更换新?#23454;?#31579;选?#22028;?#22522;;


5) 每日监测细胞,观察存活细胞率,从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非转导细胞的药物*浓?#21462;?/p>


4. 哺乳动物稳定转染细胞株的筛选


等转染含有pac基因的质粒后,细胞在含有嘌呤霉素的?#22028;?#22522;中增?#24120;?#20197;筛选出稳定转染子。


1)细胞转染48h后,将细胞(原样或稀释)置于含有?#23454;?#27987;度嘌呤霉素的新鲜?#22028;?#22522;中?#22028;?/p>


注意:当细胞处于分裂活跃期?#20445;?#25239;生素作用最明显。细胞过于密集,抗生素产生的效力会明显下降。*进行细胞分盘使其密度不超过25%。


2)每隔2-3天,移除和更换含有嘌呤霉素的?#22028;?#22522;。


3)筛选7天后评估细胞形成的病灶。病灶可能需要额外的一周或者更多时间,这依赖于宿主细胞系和转染筛选效率。注意:每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要48h,有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在3-10天。


4)转移?#22836;?#32622;5-10个抗性克隆到一个35mm的?#22028;?#30399;中,用选择?#22028;?#22522;继续?#22028;?天。此次富集?#22028;?#26159;为日后的细胞毒性实验做准备。


注意事项


1)为?#22235;?#30340;安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


2)嘌呤霉素为有?#20928;?#21512;物,操作时请小心拿放。


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